DNA，请挪步：轮到古蛋白登场揭示人类史了

原文作者：Matthew Warren

研究者从一些化石中提取出了一百多万年前的蛋白质，它们或能帮助解答围绕古人类的一系列难题。

大约16万年前的某一天，一具古人类遗骸出现在了中国青藏高原的一处洞穴里。也许这个人就是在那儿殒命的，也许骸骨是被他或她的亲属或者是食腐动物带到那里的。仅仅数年的工夫，其肉体已不复存在，骨骼的状况也开始恶化。之后又经过了几千年，期间冰川退缩、前进、又再次退缩，最终留下来的只有一小块带有些许牙齿的颚骨。这块骨头逐渐被包裹在一层矿物质外壳里，这位远古先祖的DNA被时间与气候侵蚀殆尽。但是，依然有一些来自过去的信号留存了下来。

弗洛勒斯人是科学家希望通过古蛋白质测序研究的物种之一。

来源：修改自World History Archive/Alamy

在这具古人类遗骸的牙齿内部，依稀还能辨识出已经降解了的蛋白质。科学家在今年早些时候对它们进行分析时检测到了胶原蛋白，这是骨骼及其它组织里的一种结构蛋白。在它的化学标记上有一个在现代人或尼安德特人胶原蛋白里都不存在的单个氨基酸的变异，这标志着这块颚骨属于一个神秘的、被称作丹尼索瓦人的古人类群体中的一员。中国的丹尼索瓦人是一项具有里程碑意义的重大发现。这是在西伯利亚丹尼索瓦洞以外找到的首个个体；此前，其同类的遗骸都出自那个洞穴。另外，这处遗址位于海拔3000米以上的青藏高原，这表示丹尼索瓦人能够生活在非常寒冷的低氧环境下。

这项发现还具有另一层里程碑式的意义：研究者首次仅仅凭借蛋白质就鉴定出了一个古人类。

这是古蛋白质组学（palaeoproteomics）这个新兴领域迄今为止最引人注目的发现之一。这门学科通过分析古老的蛋白质来解答有关人类和其它动物的历史和演化问题。该领域的支持者认为，由于蛋白质在化石中留存的时间要比DNA长得多，这让科学家得以探索全新的史前时期。通过运用分子工具，他们所能研究的骨骼的来源地也将比目前广泛得多。

先前，科学家已经从180万年前的动物牙齿以及380万年前的蛋壳里获取了蛋白质。现在，他们希望古蛋白质组学可以用来为探索已经不剩分毫DNA的古人类化石提供新见解：远的有190万年前到14万年前生活在世界部分地区的直立人，近的则是6万年前生活在印度尼西亚的弗洛勒斯人—一个矮小的、“霍比特”式的人科物种。通过比较他们蛋白质间的差异，科学家希望能够解答关于古人类演化的一些悬而未决的问题，例如哪几个类群是智人的直系祖先。“我认为大致上你可以解锁整棵人类演化树。”来自丹麦哥本哈根大学的生物考古学家Matthew Collins说。自从20世纪80年代以来，他就一直站在古蛋白质组学研究的第一线，当时该领域的研究者还屈指可数。

羽翼渐丰

尽管有激动人心的一面，有一部分研究者还是认为仅凭从蛋白质里获取的信息是很难将人类历史完全勾勒出来的，这是因为相较于DNA，蛋白质提供的信息量很有限。还有不少人担心因为样本污染之类的问题，古蛋白质组学这个领域可能很容易产生错误的结果。“你会看到一些很棒的研究，然后你也会看到有人发表一些千奇百怪的东西，因为那些人没有批判性地思考自己所采用的研究方法。”来自德国慕尼黑大学的考古学家Philipp Stockhammer说。

过去的二十年里，从古老化石中获取的DNA改变了科学家对人类演化的理解。通过分析不同古人类群体的DNA的异同，研究者得以绘制出错综复杂的演化树，这在从前是办不到的。而像丹尼索瓦人这样的重大发现本身也要归功于遗传物质。

根据胶原蛋白序列的鉴定结果，这块来自16万年前青藏高原的颚骨属于一名丹尼索瓦人。

来源：F. Chen et al./Nature

但在研究者描绘出的那幅图景里还留有刺眼的空白。他们只对尼安德特人、丹尼索瓦人和智人这三个古人类群体进行过DNA测序，而且标本大都来源于10万年以内（一个明显例外是来自西班牙的一对43万年前的早期尼安德特人）。把时钟再往回拨几十万年，事情就开始变得含混不清了。而根据哥本哈根大学分子人类学家Frido Welker的说法，那是一段好戏连台的时期。丹尼索瓦人和尼安德特人正是在那个时候与最终成为现代人的支系在演化树上分道扬镳。但我们对那一段人类历史仍知之甚少。例如，研究者还不知道生活在70万到20万年前的古人类海德堡人（Homo heidelbergensis）究竟是智人和尼安德特人的共同祖先，还是像一部分人提出的那样只属于尼安德特人那一支。“这类问题是古DNA所无法解答的。”Welker说道。

再往前一百万年或是更久，事情就更加不明朗了。比如说，直立人大概在190万年前首度出现在非洲。可是没有DNA证据，我们就无法确定他们与包括智人在内的晚期人族成员间的具体关系。

古DNA还留有地理上的盲区。由于DNA在温暖的环境下降解更快，所以尽管西伯利亚寒冷洞穴出土的10万年前的标本可能还保存有遗传物质，但是来自炎热的非洲或者东南亚地区的同年代化石一般都没有。因此，对于曾经生活在这些地方的古人类，如弗洛勒斯人，即便年代相对而言不那么久远，我们还是很不了解其遗传构成。

如今，研究人员希望蛋白质分析能够开始填补一些诸如此类的空白。这样的想法并不新鲜：早在上世纪50年代，研究者就已经有过在化石中发现氨基酸的报告了。只是在很长的一段时间里，对古蛋白质测序所需要的技术都不存在。“推心置腹地讲，我在自己职业生涯的绝大部分时间里，都不相信我们有朝一日能获取古蛋白质的序列。”Collins这么说道。

情况在进入21世纪后起了变化，研究者开始认识到质谱法这种用来研究现在的蛋白质的技术，也可以应用到过去的蛋白质上面。这项技术的原理是将蛋白质分解为组成它们的肽（短链氨基酸），然后再通过分析它们的质量来推断其化学组成。

研究人员使用质谱法来筛选数以百计的骨骼碎片，以鉴别它们属于哪些种类的动物。这种更细化的手段被称作动物考古质谱分析（ZooMS），研究者用它来分析一种胶原蛋白，这种蛋白的组成成分的质量在不同类群和物种间都不相同，这为研究人员提供了一个可以用来鉴定骨骼来源的特征性的印记。

2016年发表的一篇论文采用了ZooMS，研究者利用它在来自丹尼索瓦洞数以千计的骨骼碎片里，识别出了一块属于古人类的骨头，之后的DNA分析显示骨头的主人是一名混血儿——“丹妮”（Denny），她的母亲是尼安德特人，而父亲则是丹尼索瓦人。英国弗朗西斯·克里克研究所的群体遗传学家Pontus Skoglund表示，即便只有那一个成果，古蛋白质分析也已经极大地拓展了我们对人类演化的认识。而来自德国马克斯·普朗克人类历史研究所的考古学家Katerina Douka目前正在运用ZooMS，筛查来自亚洲的4万块未经鉴定的骨骼碎片，希望能从里面找出更多属于古人类的骨头。

但是，ZooMS只能勾勒出一个大致的轮廓。一旦某块骨骼被鉴定为古人类所有，还需要有别的技术来对它进行更深入的研究。因此，其他一些研究者转向了鸟枪法蛋白质组学，这种方法的目的在于鉴别出一份样本里的全部蛋白质序列，即其蛋白质组。蛋白质组的组成取决于被检验的组织类型，但它通常都会包括多种不同形式的胶原蛋白。Douka说鸟枪法可以释放出几千个信号，这使得它所能提供的信息远比ZooMS丰富，但同时也更难解读。通过将这些信号与数据库里的已知序列进行匹配，研究者就能够准确识别出他们样本里的胶原蛋白或其它蛋白质的序列。

之后，科学家可以将这种新确定的蛋白质序列与来自其他古人类的同类蛋白质进行比较，在单个氨基酸上寻找异同，这有助于将新序列的主人放置到人类演化树上相应的位置。这种做法与古DNA研究者在基因序列里寻找单个碱基的变异不无相似之处。

填补空缺

研究者曾将蛋白质分析与古DNA测序结合起来使用过，而要说只分析古人类蛋白质的话，第一个研究的便是西藏丹尼索瓦人。其他这一类的研究可能很快就会接踵而至（详见“让化石开口说话”一图），譬如通过分析海德堡人蛋白质序列，也许可以弄清楚他们与智人和尼安德特人的关系。

研究设计摘要及群组细节和数据

来源：弗洛勒斯人：P. Brown et al./Nature；丹尼索瓦人牙齿：R. Reich et al./Nature；混血儿“丹妮”：Tom Higham，牛津大学；丹尼索瓦人颚骨：F. Chen et al./Nature；纳勒迪人：L.R. Berger et al./eLife；尼安德特人：M. Meyer et al./Nature；直立人：英国伦敦自然博物馆/Alamy；斯蒂芬犀：丹麦自然博物馆；“露西”：维基共享资源（120 via Wikimedia Commons，译注：120为该网站注册用户名）；鸵鸟蛋壳：Terry Harrison

自从弗洛勒斯人的遗骸于2003年在印度尼西亚的弗洛勒斯岛上被发现以来，围绕他们究竟是什么的争论就没有停歇过。他们与其他古人类的关系并不明确，有人提出他们可能是直立人的矮化后裔，还有人甚至说他们也许是由与现代人类关系更远的南方古猿属演化而来的。这个类群生活在迄今200多万年前，著名的“露西”就是它们中间的一员。

Collins认为蛋白质组学可以解开这个谜团。“我百分百确信我们可以找到能拿来测序的弗洛勒斯人的蛋白质，而其结果将揭晓他们在人类演化树上的位置。”他说道。这可能也同样适用于另一种小个子的古人类——吕宋人（Homo luzonensis）。数年前，有人在菲律宾吕宋岛的一处洞穴里发现了吕宋人的骨骼和牙齿，这个发现是在今年早些时候报道出来的。和弗洛勒斯人的情况一样，从那些样本里提取不到DNA。来自奎松市菲律宾大学的考古学家Armand Salvador Mijares说，他正计划给Welker寄去一颗在发现吕宋人的洞穴里找到的动物牙齿，以测试对来自古代热带地区的物质进行蛋白质分析的可行性。

在研究者摩拳擦掌准备对古人类进行更多蛋白质组分析的同时，在其它动物身上开展的研究已经为我们揭示了大量关于它们在遥远过去的演化关系。

拿最近的一项研究来说，Welker和他的同事运用蛋白质组学判明了斯蒂芬犀（一个已经灭绝的犀牛属）在犀牛演化树上的位置。团队在一份尚未经过同行评议的预印本上报告说，他们成功地从来自格鲁吉亚德玛尼西遗址的近180万年前的犀牛骸骨里提取了蛋白质。氨基酸置换的模式表明这类动物与同样已经灭绝的披毛犀（Coelodonta antiquitatis）关系很近。

西藏丹尼索瓦人的蛋白质来自牙本质（牙齿里的骨骼组织），而这些斯蒂芬犀的蛋白质则是被封存在覆盖牙齿的牙釉质里。该项研究的合著者之一、来自哥本哈根大学的古蛋白质组学专家Enrico Cappellini表示，这一点对于寻找非常古老的蛋白质来说可能是非常有用的。牙釉质是脊椎动物体内最坚硬的物质，能起到防止氨基酸浸出的作用（Cappellini称之为封闭系统）。180万年这个时间“并不是什么限制”，他说道。

实际上，其他人已经突破这个限制了。研究者有过从北极地区340万年前的骆驼身上提取胶原蛋白序列的报告。另外，根据2016年发表的一篇论文，意大利都灵大学的生物分子考古学家Beatrice Demarchi和她的合作者从380万年前的鸵鸟蛋壳里提取到了蛋白质并做了测序。Demarchi说蛋壳不是保留在寒冷的极地地区，而是来自坦桑尼亚一处年平均气温在18度上下的遗址。“你不会想到这东西在那么炎热的环境下能留存至今。”她说道。也许可以在同样的地方得到古人类的蛋白质，她补充了一句：“我们得试试，不是吗？”

初生之痛

在我们可以用古蛋白质理清人类演化树之前，还有一些障碍需要克服。到目前为止，研究人员都能较为容易地推断出古人类的蛋白质序列，这是因为他们已经拥有了尼安德特人、丹尼索瓦人和智人的DNA。这些DNA让研究者得以预测可能会出现在质谱信号里的蛋白质序列。“你可以从来自远古生物或当代人的已知基因组序列里识别出你认为可能会出现的片段，然后去寻找它们。”马克斯·普朗克演化人类学研究所的古遗传学家Svante Pääbo说道。

但是当科学家研究的是年代更为久远的对象时，他们必须在没有导引的情况下解析出那些氨基酸的序列。Pääbo说那对于古蛋白质组学来说是一项持续的挑战，原因在于蛋白质会降解成小的片段，而且样本经常被来自现代的蛋白质污染。

蛋白质在这颗牙齿的釉质中保存了近180万年，它帮助我们弄清楚了一头来自格鲁吉亚德玛尼西的古代犀牛的系统发生。

来源：丹麦自然博物馆

Collins相信那是可以做到的。他指出在2015年发表的一篇论文里，他本人与Welker及其他人一道为南美洲原生有蹄类动物（一类在大约12000年前灭绝的哺乳动物，种类繁多，长相奇特）绘制出了演化树。由于缺少来自有蹄类动物化石的现成DNA，研究团队不得不从零开始对胶原蛋白进行测序，再将结果与其它动物的序列进行比较。他们发现箭齿兽和后弓兽这两种已灭绝的南美原生有蹄类与包括马和犀牛在内的一类动物关系密切，而不是像一些研究者之前设想的那样与非洲兽总目（包括大象和海牛）关系接近。

其它局限则更为根本。远古的牙齿和骨骼只含有数量很少的蛋白质，所以能用来鉴定标本的信息片段相对也比较少。拿西藏丹尼索瓦人的例子来说，研究分析得到了八种不同胶原蛋白的序列，其氨基酸的总计数略高于2000。这些氨基酸之中只有一个与尼安德特人和现代人的序列不同，正是这处不同将样本鉴定为丹尼索瓦人。这意味着即便研究人员能够对比如直立人标本里的蛋白质进行测序，那些氨基酸序列所提供的信息量可能也不足以让我们对直立人与现代人或其他古人类的关系得出任何确定性的结论。Skoglund说相较而言，单单一个古基因组就含有多达三百万处与其它任何基因组都不同的变异，因此在演化这个领域，古基因组能够提供多得多的信息。

此外，因为蛋白质经常起着至关重要的作用（比方说形成骨骼），它们并不总是随着物种的演化而改变。例如，牙釉质特有的蛋白质在丹尼索瓦人、智人和尼安德特人身上是完全相同的，所以无法用来区分他们。不过，Welker说这些蛋白质在其它大猿类之间的确有所不同，因此在研究更早期的古人类时也许能提供更多的信息。

尽管如此，研究者对古人类蛋白质序列在种群水平上的差异仍然知之甚少。举例来说，科学家只完成过一例丹尼索瓦人基因组的测序。这意味着在西藏丹尼索瓦人的鉴定上，研究团队仅仅将其蛋白质序列与一个同类比对过，而其他丹尼索瓦人可能会有不同的变异。“很多遗传学家都对这套方法持相当的怀疑态度，不过我觉得那是因为他们在理解古人类种群的基因组差异上取得了很大的进展。”Douka说。

以古为鉴

还有其它的挑战存在。一些研究者担心过多地关注古蛋白质组学，可能会导致它遭遇与古DNA领域20年前碰到的同样的麻烦。20世纪90年代到21世纪初，许多看上去激动人心的发现，如来自恐龙或虫珀的DNA，随后都因为污染或是其它方法上的问题被证明是错误的。“如果同样的事情发生在蛋白质组学领域，我是不会感到惊讶的。”Douka说。

该领域内的先驱人物意识到了这些问题，很多研究者正在共同努力以求建立一门严谨的学科。英国约克大学的考古学家Jessica Hendy就是其中的一员，她也是应用蛋白质来研究早期人类饮食的先驱者。在2018年发表的一篇论文里，Hendy和合作者在来自现今土耳其境内恰塔霍裕克、距今8000年的陶器中鉴别出了蛋白质，揭示出当地早期住民的食谱里包括了各种各样的动植物，他们甚至还把奶加工成乳清。

 “这项技术太有趣、太吸引人了，它着实博得了不少关注，特别是现在。”Hendy说。“我们真的需要谨言慎行。”她补充道。她作为第一作者，和Welker一同发表了一篇论文，概述了古蛋白质组学领域的最佳实践，涉及从防止污染到共享数据的各个方面。

Hendy还说需要有更多的关于蛋白质如何在大时间尺度上保存和降解的基础性研究。她认为这类研究也许不会成为什么大新闻，但能让研究者对自己的成果有更多的信心。她拿Demarchi的研究来当例子：Demarchi发现那枚380万年前蛋壳里的蛋白质与壳内矿物晶体的表面已经结合到了一起，这就相当于把蛋白质冷藏在那里。“她的发现妙就妙在它真正解释了蛋白质为何得以留存下来，这就让研究结果可信得多。”Hendy说。

尽管还有其他的问题需要解决，但是古蛋白质组学的发展并没有放缓的迹象。人类演化可能是其中最受关注的，但是科学家也在以其它各种各样的方式应用古蛋白质组学，比如在古老牙齿的牙石里寻找疾病的印记，比如探究中世纪的羊皮卷是用哪些动物皮制作而成的。

这一切让Demarchi感到兴奋不已。说到为灭绝已久的生物绘制演化树，她认为蛋白质组学在这一方面极具潜力。“我不觉得自己在有生之年会看到这个领域的尽头，”她说，“它大有可为。”

原文以Move over, DNA: ancient proteins are starting to reveal humanity’s history为标题

发布在2019年6月26日《自然》新闻特写上，原文链接：https://www.nature.com/articles/d41586-019-01986-x

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Nature|doi:10.1038/d41586-019-01986-x

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